icycle，英语万能王单词拼读规则？
1． 字母q总是与u在一起，读做/kw/, 此处u不作元音.
2． 字母c在字母e, y, i前读做/s/ (cent, city, cycle), 其他字母前读做/k/(cut, cap, cop).
3． 字母e, i, y之前的字母g可以读做/j/(page, giant, gym), 其中字母e, i之前的g也可以不读做/j/(get, girl, give); 其它字母之前的g读做/g/(gate, go, gust).
4． 元音a, e, o, u在音节结尾(开音节)一般读做字母音(长音a, e, o, u), 有助于学生正确划分并拼读元音字母+辅音字母+元音字母的不熟悉单词(re port…rather than rep ort).
5． 字母i和y经常读做/i/(big, gym), 但是也可读做I(silent, my, type).
6． 一个英语单词用字母y而不是i的结尾(my, by).
7． 有五种情况末尾的字母e不发音.(如me, she, 和 he的短单词末尾的字母e读做e, 较长的单词末尾的e不发音)
尾字母e不发音应该被认为是”having a job” (承担一项工作)
7.1 bake gene time/type code cute 使他前面的元音字母发字母音..
7.2 love give blue true 使我们不要以一个v和一个u结束一个单词.
7.3 chance bodice charge allege 使g和c读软音/j/和/s/.
7.4 lit tle cas tle bot tle dab ble fid dle 避免一个音节没有一个元音字母.
7.5 are nurse raise bye ewe owe cause 这一条被Spalding女士叫做无工作尾字母e; Sanseri女士叫做老工作尾字母e, 并说前四条之外的不发音尾字母e都叫做老工作尾字母e.
7.5.1 使一个不是复数形式的单词不要以s结尾(dense而不是dens, purse不是purs, false 不是 fals).
7.5.2 加长短的主意词(main-idea), 如awe, ewe, rye
7.5.3 区分同音异形词的含义. 如or/ore for/fore.
7.5.4 中英语和外来语中(那里的尾字母e是要发音的)留下来的, 现在不发音. 如treatise giraffe
8.有五种字母组合发/er/的音/, 记住下面的句子.
Her nurse first works early. 这个句子是按英语用法中的降序排列的.
另外,or在w后业可以发/er/的音. 还要记住有些词尾的ar和or也发/er/的音.如dollar, doctor.
9. 1-1-1规则: 单音节单词中, 结尾是单元音加单个辅音的, 在添加以元音开始的词尾变化时, 需要将末尾的辅音字母再写一次再加词尾变化.(如hop---hop ped). 但是词尾是x除外, 因为它由两个音/ks/.
10. 2-1-1规则: 双音节词中, 结尾是单元音加单个辅音的, 在添加以元音开始的词尾变化时, 需要将末尾的辅音字母再写一次再加词尾变化(be gin--- be gin + ning). 第二个音节不重读的不能双写末尾辅音字母(en ter, prof it, bud get).
11. 去e规则, 以不发音的e结尾的单词在添加以元音开始的词尾变化是需要去掉末尾不发音的e.(come----coming)
12. 是ie还是ei? 一般情况下, 应该是ie, 但是1) c之后用ei; 2)发字母a的音时, 用ei(neighbor, weigh, vein). 还有下面的例外情形Neither foreign sovereign seized counterfeit forfeited leisure. Plus: either weird protein heifer:
13. 音素sh用在一个基本词的开头或是结尾(she, dish), 还用在一个音节的结尾(fin ish), 但绝对不会在后一个音节的开头, 除非是以ship结尾(wor ship, friend ship).
14. 音素si, ti, ci最常用在一个基本词的第二及以后的开头, 发音/sh/. 常常可以通过考察词根和根词来确定发/sh/时用什么样的音素.比如
infect to in fec tious / collect to col lec tion / potent to po ten tial
music to mu si cian / space to spa cious / finance to fi nan cial
soci (companion) to so cial / ancien (old) to an cient
cruc (cross) to cru cial / speci (kind) to spe cial
15. 音素si在前一个音节以s结尾时(ses sion)发/sh/, 一个基本词经过词尾变化后只有一个s(tense---tension), 其中的音素si发/sh/.
discuss to dis cus sion / compress to com pres sion / admis to ad mis sion
16. 音素si可以发/zh/, 如vi sion, di vi sion, oc ca sion, ex plo sion.
17. 只有一个元音的单音节词,常常双写词尾的l, s, f. 比如will, off, miss. 有时双音
节词也用到这条规则, 如re cess
18. 词尾为长音a时, 常用ay在词尾而不是a. (bay, day, decay)
19. 元音i和o后面有两个辅音时,常发长音. (find, old)
20. s从不在x后, 音素x包含一个/s/音, /ks/.
21. 去L规则1: all单独出现有两个l, 但在前缀中只有一个l.(al most, al so, al though).
22. 去L规则2: till和full单独出现有两个l, 作后缀只有一个l. (un til, plen ti ful).
23. 音素dge只用在单元音后面,而且这个元音发短音(badge, edge, bridge, lodge, budge).
24. Y变I规则: 进行词尾变化时, 词尾是一个辅音字母+y, 要变y为i. 下列两种情况驻外(1)加-ing, (2)变后会引起音节分裂.
city/cit ies beauty/beau ti ful play/player funny/fun ni est
multiply/mul ti ply ing rely/re li able cry/cried deny/denied
25. 音素ck只用在单元音后, 而且这个元音发短音(back, neck, lick, rock, duck).
26. 字母开头的z永远发/z/, 不会发/s/.
27. 音素ed有三个音, 基本词以/t/和/d/音结尾, ed发/ed/(divide---divided, heat---heated); 基本词以浊辅音结尾的, ed发/d/( lived), 以清辅音结尾的发/t/(stopped)
28. 单词常常(always)在双辅音间分音节[但要注意不要把辅音字母组合分开(如ma the ma tic)], 重读音节的辅音才发音, 非重读音节的辅音不发音lit tle.
翻译时, consonant译作辅音, vowel译作元音。
y什么时候发音i和ai？
字母y是一个比较特殊的字母，他被叫做半元音字母，当这个字母作为元音字母使用的时候，它的读音就是/ai/，一般情况下位于单词的词尾或者词中，比如：my，why，fly，dry，fry，deny，cycle，cyber等等。而出现在词首的时候，通常读辅音/j/，例如：you，young，yes。
BIM具体有哪些应用？
一直有人纠结要不要学习BIM，学怕太难，不学，怕被淘汰，在学习BIM之前你要明白一件事，什么是BIM？
我们来聊聊B、I、M三个单词所代表的意义。
B
❶ B是building，国内直接的翻译是建筑。但其实这是不准确的翻译。Building所代表的不是建筑，而是土建类（或者称为建设领域），那什么叫土建类？
❷ 引用百度百科的话，就是指一切和水、土、文化有关的基础建设的计划、建造和维修，包括城市规划，土木工程，交通工程等学科。包括建筑学，城市规划，土木工程，交通工程 ，涉外工程，环境工程，建筑环境与设备工程，建筑技节能技术与工程，城市地下空间工程，历史建筑保护工程，景观建筑设计，水务工程，农业工程，设施农业科学与工程，建筑设施智能技术，给排水科学与工程，建筑电气与智能化，景观学，风景园林，道路桥梁与渡河工程，工程管理。
❸ 所以B代表的是BIM的广度，也就是整个建设领域，它可以是建筑的某一具体部分（如水暖电、土方工程等），可以是单体建筑，也可以是社区，更可以是一个城市，甚至可以大到人与自然的关系。
❹ 举例来说，土方工程使用civil 3d就是具体部分，使用revit来建立整栋大楼的三维模型等就是单体建筑；CIM（关于CIM现在有两种说法，一种是City Intelligent Model，城市智慧模型，这种说法在大陆比较常见；一种说法是日本提出的Construction Information Modeling/Management，这种代表的是非建筑工程类的BIM，而让BIM专属于建筑工程类 ），就是社区及城市（虽然实际功能达不到城市的范围）；帝国理工的Blue-Green Dream（将BIM和环境工程结合起来）就是人与自然的关系。
I
然后是I。I是information，也就是信息。虽然美国有种观点认为，I代表的是integration，也就是集成，但我更倾向于使用information。因为我觉得information更能代表BIM的本质。
关于I，要分三部分来回答。
❶ 第一部分是，到底什么才算是information呢？也就是I的含义。
❷ 我认为这里应该包含两层意思，一是信息（名词），也就是建设领域中所包含的各种信息；二是信息化（动词），也就是建设领域的方方面面都会采用信息化的方法和手段。
❸ 信息好理解，比如说梁的参数、项目的进度、项目的说明之类的，都是建设领域的信息；信息化，也就是利用计算机、人工智能、互联网、机器人等信息化技术及手段，来实现建设领域的信息化及智能化。
第二部分是，I的范围。
❶ I的范围是基于建设项目（注意是建设项目，不是单体建筑，而是整个建设领域）全生命周期（从概念产生到项目报废）的信息化过程。（可以参见文章“淺談BIM應用工具(一):序曲/謝尚賢”BIM 工程資訊模擬與管理研究中心）
❷ 具体如大家常见的这个图:
❸ 具体的应用（根据国内的项目阶段对上图的阶段做了些整合）就是：
❹ 项目概念阶段：项目选址模拟分析、可视化展示等等；
❺ 勘察测绘阶段：地形测绘与可视化模拟、地质参数化分析与法案设计等等；
❻ 项目设计阶段：参数化设计、日照能耗分析、交通线规划、管线优化、结构分析、风向分析、环境分析等等；
❶ 招标投标阶段：造价分析、绿色节能、方案展示、漫游模拟等等；
❷ 施工建设阶段：施工模拟、方案优化、施工安全、进度控制、实时反馈、工程自动化、供应链管理、场地布局规划、建筑垃圾处理等等；
❸ 项目运营阶段:智能建筑设施、大数据分析、物流管理、智慧城市、云平台存储等等；
❹ 项目维护阶段：维修检测、清理修整、火灾逃生模拟等等；
❺ 项目更新阶段：方案优化、结构分析、成品展示等等；
❻ 项目拆除阶段：爆破模拟、废弃物处理、环境绿化、废弃运输处理等等。
❼ 当然BIM所能做的事远不止这些，这里只是选取部分来举例而已。
第三部分是I的趋势
❶ 所以未来的建设领域，必然是一个高度信息化和智能化的过程。这点美国已经远远走在了我们的前面。
❷ 所以I代表的是BIM的深度，也就是基于建设项目全生命周期管理（Building Lifecycle Management，BLM）的信息化过程。当然更重要的是要学会使用信息化的思想和方法去处理对待建设项目。
M
然后就是M，modeling。
❶ modeling的含义。M的英文是modeling,现在国内的翻译是模型，我是旗帜鲜明地反对这种翻译的，因为model才是模型，modeling所表现的是一个过程，而不是一个模型。翻译成模型会给人很多误导，尤其是给不了解BIM的人。我个人倾向于翻译成“模拟”。
❷ M这个词也代表了一种model，只不过这种model在这里指的不是模型，而是一种工作方式，也就是我之前所说的IPD模式。什么是IPD模式呢？简单来说，就是在开始动工前，业主就召集设计方、施工方、材料供应商、监理方等各方面一起做出一个BIM模型，这个模型其实是“类竣工模型”或者是“拟完成作品的模型”，大家会尽量根据这个模型去做实际建设，如果中间建设过程有变动再来进行模型的修改，到最后项目建好模型也随之修改好。但为什么是IPD而不是其他的？后续我会专门安排一篇文章来讲讲IPD的概念、流程、现状等等。本文重点讲的是BIM的本质，也就是Big BIM，这里不多做叙述。
❸ M也表示my-life。为什么说my-life？因为有了BIM，所以交通设计会更加合理，古建筑会更好的保护，结构会更加的安全，城市规划也会更加完善。
所以M代表的是BIM的力度。BIM终将改变整个行业，乃至改变我们的生活。
来源于网络，侵删
自然拼读口诀？
1.字母q总是与u在一起，读做/kw/, 此处u不作元音。
2.字母c在字母e, y, i前读做/s/ (cent, city, cycle), 其他字母前读做/k/(cut, cap, cop)。
3. 字母e, i, y之前的字母g可以读做/j/(page, giant, gym), 其中字母e, i之前的g也可以不读做/j/(get, girl, give); 其它字母之前的g读做/g/(gate, go, gust)。
4.元音a, e, o, u在音节结尾(开音节)一般读做字母音(长音a, e, o, u), 有助于学生正确划分并拼读元音字母+辅音字母+元音字母的不熟悉单词(report…rather than report)。
5. 字母i和y经常读做/i/(big, gym), 但是也可读做/aɪ/(silent, my, type)。
6. 一个英语单词用字母y而不是i的结尾(my, by)。
7. 有五种情况末尾的字母e不发音.(如me, she, 和 he的短单词末尾的字母e读做e, 较长的单词末尾的e不发音) 尾字母e不发音
分子鉴定技术发展历程？
分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。通俗简单的讲所有基于分子生物学水平的方法学技术都属于分子诊断技术，比如PCR技术、基因测序技术等等。
PCR技术即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性，模板DNA与引物的退火(复性)，引物的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。简单讲PCR技术本质上是针对DNA片段进行扩增放大，通过实时荧光PCR技术使得样本中DNA含量可以检测出来。
基因测序技术即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。简单讲基因测序技术是针对DNA片段进行测序和分析，使得DNA序列得以清晰。
下面一起来了解一下分子诊断技术近50年的发展历程：
一、基于分子杂交的分子诊断技术
上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年,由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增,人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现,为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。
(一)DNA印迹技术(Southern blot)
Southern[1]于1975年发明了DNA印迹技术,通过限制性内切酶将DNA片段化,再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离,通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上,再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交,保证了检测的特异性。因此,一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运用于各种基因突变,如缺失、插入、易位等,及与限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鉴定中。Alwine等[2]于1977年推出基于转印杂交的Northern blot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。
(二)ASO反向斑点杂交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)
使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性,但存在操作极为繁琐,检测时间长的缺点。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使对核酸序列点突变的检测成为可能。1986年,Saiki[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来,实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki[4]又发明了ASO-RDB,通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色,进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上,只需通过1次杂交反应,即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因,具有操作简单、快速的特点,一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。
(三)荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)
FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin[5]首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势,可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针,可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。
如今,FISH已在染色体核型分析,基因扩增、 基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)与光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技术,使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。
(四)多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)
MLPA技术于2002年由Schouten等[6]首先报道。每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列完全杂交,连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有1个碱基的差别,就会导至杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,便可对把核酸序列进行检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。
该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经过MRC-Holland公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系,是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。
(五)生物芯片
1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列,标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日,芯片技术已经得到了长足的发展,如果按结构对其进行分类,基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。
1.微阵列芯片
(1)固相芯片:微阵列基因组DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史,其技术平台主要分为2类,即微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNP array)。顾名思义,aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化,而单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较,直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信息。随着技术的不断进步,目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。MGDP芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。经验证,使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%[8],表达谱芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片绘制了mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视,目前也已出现microRNA芯片、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。类似于MGDP芯片,GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交,从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。相较于基因组杂交,GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测,对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果;
(2)液相芯片:传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列,而Luminex公司的xMAP技术[10]则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料,将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色,并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上,使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交,使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪,其中红色激光检测微球编码,绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度,一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前,该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。
2.微流控芯片
1992年Harrison等[11]首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想,通过分析设备的微型化与集成化,完成传统分析实验室向芯片上实验室(lab-on-chip)的转变。微流控芯片(microfluidic chip)由微米级流体的管道、反应器等元件构成,与宏观尺寸的分析装置相比,其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比,以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能,从而在1张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列实验过程。
目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。
二、核酸序列测定
测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。
(一)第1代测序
1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法,随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型,为核酸测序时代的来临拉开了序幕。
Sanger等于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,DNA合成反应便会终止。如果分别在4个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP,则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自显影,根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基础上,于1986年推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A,并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。Sanger测序是最为经典的一代测序技术,仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。
(二)第2代测序
1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)
不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相[13]与液相[14]载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光,通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念,焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量,因此在SNP位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于荧光报告原理不同,其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高,目前尚未得到大规模的临床使用。
2.高通量第2代测序
目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应,使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应,完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测,在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。然而,由于该技术需要对DNA进行片段化处理,测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp),需要对数据进行大规模拼接,因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求,以利于后期的测序数据分析。
(三)第3代测序
第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本,可对混杂的基因物质进行单分子检测,故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化,并最终投入临床应用仍有很长的距离。
三、基于分子构象的分子诊断技术
(一)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)
1970~1980年间,Fischer等[15]与Orita等[16]分别提出了利用核酸序列变异所导至双链变性条件差异与单链空间折叠差异,通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定的方法,即DGGE与SSCP。上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异,通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性,且对于序列的改变非常敏感,常常1个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE与SSCP均必须进行PCR后开盖电泳的操作,现已不常见于临床检测。
(二)变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)
1997年,Oefner和Underhill建立[17,18]了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术,称为dHPLC,可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。对于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物,其经过变性和复性过程后,体系内将出现2种双链:一种为同源双链,由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链;另一种为异源双链,即双链中1条单链为野生型,而另1条为变异型。由于存在部分碱基错配的异源双链 DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因存在错配区而更易变性,被色谱柱保留的时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测,可快速检出<5%负荷的变异序列。但需注意的是,由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测,其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。
(三)高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)
2003年,Wittwer等[19]首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记,再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。该技术的原理也是通过异源双链进行序列变异鉴定。待测样本经PCR扩增后,若存在序列变异杂合子,则形成异源双链,其熔解温度大大下降。此时由于双链被饱和染料完全填充,其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合子而言,HRMA也可利用其较高的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定,但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP的纯合子变异则无法有效区分。
如何利用DNA构象对序列进行推测,从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。目前,使用构象变化对序列变异进行间接检测的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。但需要注意的是,由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证,因此其只适合大规模的初筛,而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。
四、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)
相比于其他分子诊断检测技术,qPCR具有2项优势,即核酸扩增和检测在同一个封闭体系中通过荧光信号进行,杜绝了PCR后开盖处理所带来扩增产物的污染;同时通过动态监测荧光信号,可对低拷贝模板进行定量。正是由于上述技术优势,qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术,在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。但伴随着qPCR技术的迅猛发展,有关这项技术的质量管理问题也日益突出,如何消除各类生物学变量所引起的检测变异,减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术面临的难题。
(一)实时荧光定量PCR(real-time PCR)
1.双链掺入法
1992年Higuchi等[20-21]通过在PCR反应液中掺入溴乙锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进行测定,提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线,定量反应体系中初始模板的反应动力学(real-time PCR)模型,开创了通过实时闭管检测荧光信号进行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA双链,且只有嵌入双链时才释放荧光,在每1次的扩增循环后检测反应管的荧光强度,绘制荧光强度-热循环数的S形核酸扩增曲线,以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值(Cycle threshold,Ct),则Ct与反应体系中所含初始模板数量呈负指数关系,推断初始模板量。随后Morrison[22]提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR Green I进行反应体系中低拷贝模板定量的方法。这一方法操作简便,但由于仅使用扩增引物的序列启动核酸扩增,其产物特异性无法得到充分保证。虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物特异性进行检验,但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测,因此双链掺入法并未在临床实践中得到认可。
2.Taqman探针
由于双链掺入法存在特异性较低的问题,1996年Heid[23]综合之前发现的Taq酶的5'核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针的概念提出了使用Taqman探针进行qPCR的方法。Taqman探针的本质是FRET寡核苷酸探针,在探针的5'端标记荧光报告基团,3'端标记荧光淬灭基团,利用Taq酶具有5'3'外切酶活性,在PCR过程中水解与靶序列结合的寡核苷酸探针,使荧光基团得以游离,释放荧光信号。从而使能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光,通过real-time PCR的原理对其进行定量。由于其超高的特异性与成功的商品化推广,Taqman探针已经成为目前临床使用最为广泛的qPCR方法,其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等方面具有着不可替代的地位。
3.分子信标
同样在1996年,Tyagi等[24] 提出了使用分子信标(moleuclar beacons)进行qPCR的方法,分子信标是5'与3'端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核苷酸探针,其两端具有互补的高GC序列,在qPCR反应液中呈发夹结构,荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移(FRET)而保持静息状态。当PCR反应开始后,茎环结构在变性高温条件下打开,释放荧光;在退火过程中,靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性,不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭,通过检测qPCR体系中退火时的荧光信号强度,便可以real-time PCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。相比于Taqman探针,分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合,大大降低了检测的荧光背景,其检测特异性较Taqman探针更高,更适合等位基因的分型检测。
4.双杂交探针
1997年,Wittwer等[25]发表了使用分别标记荧光供体基团与荧光受体基团的2条相邻寡核苷酸探针进行qPCR的方法。双杂交探针所标记的供体基团和受体基团的激发光谱间具有一定重叠,且2条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。仅当2条探针与靶基因同时杂交时,供体与受体基因得以接近,从而通过FRET发生能量传递,激发荧光信号,荧光信号强度与反应体系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2条探针进行靶序列杂交,该方法的特异性比传统单探针检测体系得到了极大地提升。
(二)数字PCR
早在上世纪90年代就出现了使用微流控阵列对单次qPCR反应进行分散检测的概念。基于这一理念,Vgelstein与Kinzter[26]于1999年发表了数字PCR(digital PCR)的方法,对结肠癌患者粪便中的微量 K-RAS基因突变进行了定量。相比于传统的qPCR方法,数字PCR的核心是将qPCR反应进行微球乳糜液化,再将乳糜液分散至芯片的微反应孔中,保证每个反应孔中仅存在≤1个核酸模板。经过PCR后,对每个微反应孔的荧光信号进行检测,存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号,没有靶模板的反应孔就没有荧光信号,以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。因此,数字PCR是1种检测反应终点荧光信号进行绝对定量的qPCR反应,而非以模板Ct值进行核酸定量的real-time PCR。
经由Quantalife公司开发(已于2011年被BIO-RAD收购)的微滴式数字PCR是首款商品化的数字PCR检测系统,目前已被广泛运用于微量病原微生物基因检测、低负荷遗传序列鉴定、基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统qPCR相比较,该技术具有超高的灵敏度与精密度,使其成为目前qPCR领域的新星。
五、对未来5年的展望
半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。概而言之,在过去的50年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升:即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化,操作方法由手工操作向全自动化转化,检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化;检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。
在未来5年中,我国分子诊断事业将迎来两方面的进步。随着卫生监管部门对分子诊断重要性的认识不断深入与越来越多高学历、高素质人才的进入,分子诊断将会出现理念的革命性进步,高通量技术将更多的进入临床的实际应用中。随着技术的进一步发展,传统针对特定基因异常、病原微生物感染鉴定的方法学,也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足的进步。对于传统人力与时间成本较高的检测方法学,将出现两极分化的态势,即Southern等经典的检测金标准将得到保留;而ASO-RDB等灵敏度、特异性均不能满足实际临床需求的方法将快速被新型技术所取代。最终,分子诊断也必将一改目前仅仅用于病原微生物基因检测与部分遗传性疾病诊断的局面,形成由肿瘤学、遗传学、微生物学、药物基因组学四足鼎立,快速发展的景象。
打开APP阅读更多精彩内容声明：本文内容及配图由入驻作者撰写或者入驻合作网站授权转载。文章观点仅代表作者本人，不代表电子发烧友网立场。文章及其配图仅供工程师学习之用，如有内容图片侵权或者其他问题，请联系本站作侵删。 侵权投诉
相关文章
芯片
DNA
回顾手机摄像头的发展历程
2021-01-262937
新冠疫情引爆分子诊断市场,2020年全球分子诊断市场将超过150亿美元
2020-11-051713
人工智能在分子诊断市场有怎样的应用
2020-01-16976
带你了解一下什么是USB 3.1接口
2019-09-237122
AMD经典处理器的发展历程
2019-07-135017
分子诊断IVD设备的发展史
2019-07-088586
Eurofins 收购分子诊断公司TGI,以扩大诊断市场
2019-06-282618
临界模式下的PFC做一下简单的推导
2018-09-035093
宏碁智能佛珠了解一下
2018-08-082276
讲述Numonyx封装技术的发展历程
2018-06-261947
生物传感的发展历程、热点及技术挑战
2018-02-2814045
国产“龙芯”了解及发展历程回顾
2012-12-035602
分子诊断速度崛起 医疗器械企业竞相入场
2012-11-292106
中国铅酸蓄电池技术发展历程
2009-10-29767
印制板制造技术发展50年的历程
2006-04-16307
电子发烧友网
收听电子行业动态，抢先知晓半导体行业
查看
